پایان نامه بررسی شاخص های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری

پایان‌نامه جهت اخذ درجه کارشناسی‌ارشد
 رشته مهندسی کشاورزی
 عنوان:
بررسی شاخص­های پیری و ردیابی ژن آلفامانوزیداز مرتبط با پیری در چند رقم گیلاس

با فرمت قابل ویرایش word

تعداد صفحات: 90  صفحه

تکه های از متن به عنوان نمونه :

فهرست مطالب:

1- مقدمه و کلیات…………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-1- مقدمه……………………………………………………………………………………………………………………. 2

1-2- اهداف…………………………………………………………………………………………………………………… 3

1-3- فرضیه­ ها………………………………………………………………………………………………………………… 4

2- سابقه تحقیق…………………………………………………………………………………………………………………….. 6

2-1- خاستگاه و گیاهشناسی گیلاس………………………………………………………………………………… 6

2-2- طبقه­بندی ارقام گیلاس……………………………………………………………………………………………. 7

2-3- کیفیت میوه……………………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-1- آنتوسیانین……………………………………………………………………………………………………. 7

2-3-2- اسیدیته………………………………………………………………………………………………………… 8

2-3-3- مواد جامد محلول…………………………………………………………………………………………. 8

2-3-4- سفتی بافت…………………………………………………………………………………………………… 9

2-3-5- کلروفیل و کاروتنوئید…………………………………………………………………………………….. 9

2-3-6- کربوهیدرات­ها……………………………………………………………………………………………. 10

2-4- بلوغ و رسیدگی در گیلاس……………………………………………………………………………………. 10

2-5- انبارمانی گیلاس…………………………………………………………………………………………………… 11

2-6- فیزیولوژی تنفس…………………………………………………………………………………………………… 12

2-7- اسید آبسیزیک……………………………………………………………………………………………………… 13

2-8- پیری……………………………………………………………………………………………………………………. 14

2-9- کنترل ژنتیکی متابولیسم گیاه…………………………………………………………………………………. 14

2-10- آنزیم آلفامانوزیداز و نقش آن در رسیدگی……………………………………………………………. 15

3- مواد و روش کار……………………………………………………………………………………………………….. 18

3-1- زمان و مکان آزمایش……………………………………………………………………………………………. 18

3-2- بخش بیوشیمیایی…………………………………………………………………………………………………. 18

3-2-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 18

3-2-2- طرح آماری آزمایش……………………………………………………………………………………. 18

3-2-3- اندازه­گیری سفتی……………………………………………………………………………………….. 19

3-2-5- اندازه­گیری آنتوسیانین………………………………………………………………………………… 19

3-2-6- اندازه­گیری کلروفیل دم میوه……………………………………………………………………….. 19

3-2-7- اندازه­گیری مواد جامد محلول میوه……………………………………………………………… 21

3-2-8- اندازه­گیری اسیدیته قابل تیتراسیون میوه………………………………………………………. 21

3-2-9- اندازه­گیری قند…………………………………………………………………………………………… 21

3-2-9-1- مواد مورد نیاز………………………………………………………………………………….. 21

3-2-9-2- استخراج قند…………………………………………………………………………………….. 22

3-2-9-3- اندازه­گیری قند کل……………………………………………………………………………. 22

3-2-9-4- منحنی استاندارد قند کل……………………………………………………………………. 23

3-2-9-5- اندازه­گیری فروکتوز………………………………………………………………………….. 23

3-2-9-6- تهیه نمودار استاندارد فروکتوز……………………………………………………………. 24

3-3- بخش بیوتکنولوژی……………………………………………………………………………………………….. 25

3-3-1- مواد گیاهی………………………………………………………………………………………………… 25

3-3-2- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………. 25

3-3-3- طراحی آغازگرها………………………………………………………………………………………… 26

3-3-4- تکثیر قطعات انتخابی………………………………………………………………………………….. 27

3-3-5- ارزیابی محصول PCR به وسیله تکنیک الکتروفورز ژل آگارز………………………… 28

3-3-6- توالی­یابی محصول PCR…………………………………………………………………………….. 28

3-4- تجزیه و تحلیل آماری……………………………………………………………………………………………. 28

4- نتایج و بحث………………………………………………………………………………………………………… 30

4-1- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر سفتی میوه گیلاس…………………………….. 30

4-2- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر تغییرات آنتوسیانین میوه گیلاس………… 33

4-3- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه گیلاس 36

4-4- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان مواد جامد محلول میوه گیلاس…. 42

4-5- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان اسیدیته قابل تیتراسیون میوه گیلاس 45

4-6- تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر میزان قند کل و فروکتوز میوه گیلاس…. 48

4-7- استخراج DNA…………………………………………………………………………………………………… 53

4-8- نتایج حاصل از طراحی آغازگر………………………………………………………………………………. 54

4-9- تکثیر ژن آلفامانوزیداز در پنج رقم گیلاس……………………………………………………………… 54

4-10- بررسی نتایج حاصل از توالی­یابی و همردیف­سازی توالی­های بدست آمده……………….. 56

4-11- روابط فیلوژنی توالی­های مورد بررسی…………………………………………………………………. 60

4-12- نتیجه­گیری کلی………………………………………………………………………………………………….. 61

4-13- پیشنهادات…………………………………………………………………………………………………………. 62

فهرست منابع……………………………………………………………………………………………………………….. 64

چکیده:
 این کار تحقیقی در دو بخش بیوشیمیایی و بیوتکنولوژی در محل آزمایشگاه علوم باغبانی دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انجام شد. در بخش بیوشیمیایی، جهت بررسی تاثیر کاربرد پس از برداشت اسید آبسیزیک بر شاخص­های کیفی و روند پیری دو رقم زودرس و دیررس گیلاس، آزمایشی فاکتوریل در قالب طرح بلوک­های کامل تصادفی و در چهار تکرار صورت گرفت. تیمار اول، رقم (کرج و تکدانه) و تیمار دوم، اسید آبسیزیک (در دو غلظت صفر و ppm200) مورد بررسی قرار گرفتند. میوه­ها در فواصل زمانی پنج روز و طی مدت 20 روز از زمان برداشت، از لحاظ تغییرات صفات کیفی ارزیابی شدند. طبق نتایج بدست آمده، با گذشت زمان، سفتی در هر دو رقم کاهش یافته، و در نمونه­های تیمار شده با اسید آبسیزیک کاهش بیشتری نشان داد. میزان آنتوسیانین روند افزایشی داشت. میزان کلروفیل کل و کاروتنوئید دم میوه­ها با گذشت زمان به طور معنی­داری کاهش یافت. مواد جامد محلول میوه­ها تا روز دهم کاهش و در روز پانزدهم افزایش پیدا کرد. اسیدیته میوه­ها روند نزولی داشت و در روز بیستم اختلاف معنی­داری بین نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده مشاهده شد. با گذشت زمان در میزان قند کل میوه­ها تغییر معنی­داری مشاهده نشد اما به طور کلی تغییرات قند کل دارای روند افزایشی بود. روند تغییرات فروکتوز برای نمونه­های تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک، در رقم کرج معنی­دار نبود اما بین رقم تکدانه تیمار شده و تیمار نشده با اسید آبسیزیک اختلاف معنی­داری در روز 15 و 20 مشاهده گردید. با توجه به این نتایج، می­توان نقش اسید آبسیزیک را در ایجاد تغییرات کیفی و همچنین تاثیر بر روند پیری میوه­ها، مورد توجه قرار داد. در بخش بیوتکنولوژی، ژن آلفامانوزیداز (یک ژن مرتبط با پیری) برای اولین بار، در پنج رقم مختلف گیلاس شناسایی و تعیین توالی شد. به این منظور، آغازگرهای رفت و برگشت ژن مورد نظر از طریق مراجعه به پایگاه داده NCBI و استفاده از توالی­های مربوط به ژن آلفامانوزیداز برای هلو و فلفل، با استفاده از کپی کامل cDNA هلو و فلفل طراحی شد. به علت زیاد بودن طول ژن سه جفت آغازگر طراحی شد گه این آغازگرها قادرند طول 3100 جفت­باز را پوشش دهند. همچنین دمای اتصال آغازگرها با استفاده از برنامه گرادیانت PCR بدست آمد. بعد از استخراج DNA ارقام گیلاس، یک قسمت از ژن مذکور تکثیر، توالی­یابی (با استفاده از نرم­افزار سنگر) و همردیف­سازی توالی­ها انجام شد و نمودار دندروگرام مربوط به آن با استفاده از نرم‌افزار 3 View رسم گردید. بررسی و مقایسه توالی­های معکوس، شباهت و تفاوت­هایی را در ارقام مختلف نشان داد که بر طبق آن ارقام پیش­رس (ER)، پیش­رس خارجی (FE) و دیررس (LR) دارای شباهت بیشتر بوده و در یک گروه قرار گرفتند. ارقام پیش­رس قزوین (GH) و دوم­رس (MR) دارای تفاوت بیشتری نسبت به سه رقم اول بوده و با یکدیگر نیز تفاوت نشان داده و هرکدام به طور جداگانه یک گروه مجزا را تشکیل دادند.این تفاوت­ها می­توانند در عملکرد ژن و در نتیجه رفتار گیاه تاثیرگذار باشند. به عنوان مثال، با مطالعات بیشتر و استفاده از تکنیک­های مهندسی ژنتیک، می­توان علت زمان­های متفاوت رسیدگی و تفاوت در طول عمر انبارمانی موجود در ارقام مختلف گیلاس را در این اختلاف توالی‌ها جستجو نمود. فصل اول: مقدمه و کلیات 1- مقدمه و کلیات 1-1- مقدمه از دیرباز پدیده­ی عمر یکی از مسائل مهم حیات بوده است. از این­رو افزایش عمر برای موجودات گیاهی، جانوری و یا انسان می­تواند حائز اهمیت باشد. پیری در گیاهان به عنوان مرحله­ی نهایی نمو تعریف شده است. از مشخصه­های بارز پیری کنترل روند تغییرات بسیار منظم و کنترل شده فعل و انفعالات فیزیولوژیکی است. از جمله مهمترین این رخدادها توقف فتوسنتز، تجزیه کلروپلاست، کاهش چشمگیر کلروفیل و شکستن پروتئین­ها و لیپید­ها و سایر مولکول­های بزرگ می­باشد (نواب پور و همکاران، 2003). در میوه­های فرازگرا اتیلن عامل اصلی پیر شدن میوه می­باشد و کنترل اتیلن از مکانیسم­های اصلی جلوگیری از پیری در این میوه­ها است. اما گیلاس یک میوه­ی نافراز­گرا است. این میوه دارای ارقام متفاوتی از نظر طول عمر می­باشد که شناسایی عوامل دخیل در تعیین طول عمر در ارقام زودرس و دیررس می­تواند منجر به افزایش طول عمر گیلاس گردد. طی رسیدن میوه، دسته­ای از فرآیندهای بیوشیمیایی که از لحاظ ژنتیکی در گیاه برنامه­ریزی شده­اند رخ می­دهد که باعث تغییر ویژگی­های میوه‌ی نارس و تبدیل آن به میوه‌ی رسیده می‌شود (برامل، 2006). همچنین بعد از برداشت محصولات، تغییرات مختلف ساختاری ادامه می­یابند که در جهت تخریب بافت میوه عمل می­کنند (یو و همکاران، 2003). نرم شدن بیش از حد میوه­ها مساله­ای است که عمر پس از برداشت آنها را کاهش می­دهد. در محصولات تراریخته با تغییر در بیان ژن پروتئین­ها و آنزیم­هایی که بر ویژگی­های دیواره­ی سلولی تاثیرگذار هستند، می­توان میزان فعالیت و تاثیر آنزیم­هایی مثل پلی گالاکتوروناز را در روند رسیدگی و نرم شدن محصول بررسی کرد (برامل و هارپستر، 2001 و واکابایاشی، 2000). نرم شدن و تغییرات بافتی طی رسیدن میوه­ها در هر گونه­ی خاص، ویژگی­های مخصوص به خود را داراست (برامل و همکاران، 2004). علاوه بر این، تحقیقات نشان داده است که آنزیم­های آلفامانوزیداز (α-Man) و بتادی ان استیل هگزوسامینیداز (ß -Hex) در رسیدگی و نرم شدن میوه­های نافراز­گرا نقش دارند (قوش و همکاران، 2010). با توجه به نافراز­گرا بودن میوه­ی گیلاس، مشخص نیست که بین ارقام زود­رس و دیر­رس این میوه چه بخشی از ژن­های α-Man و ß-Hex و ژن توسعه­ی سلولی (EXP) باعث تفاوت در طول عمر انباری گیلاس­های زود­رس و دیر­رس می­گردد. همچنین مشخص نمی­باشد که شاخص­های پیری بین دو رقم زود­رس و دیر­رس چه تفاوتی از نظر فعالیت­های آنزیمی α-Man و ß -Hex، لیپاز، پروتئاز و همچنین مقادیر قند، مواد جامد محلول، نشاسته، ساکارز سینتئاز و اینورتاز در طی دوران رسیدگی و پیری دارند. تفاوت الگوی ژنی این آنزیم­ها در سطح ژنومیک نیز مشخص نیست. در این پژوهش، توالی­ یک ژن­ نامزد عامل پیر شدن به نام آلفامانوزیداز از پایگاه اطلاعاتی ژنوم هلو و فلفل استخراج گشت. بر اساس توالی به دست آمده و کاربرد نرم افزار پرایمر3، توالی پرایمرهای اختصاصی مناسب برای تکثیر این ژن نامزد، طراحی و سپس ساخته شد و ژن­ مربوطه از DNA ژنومیک گیلاس استخراج و به کمک دستگاه ترموسایکلر و روش زنجیره­ای پلیمراز تکثیر و سپس به کمک دستگاه توالی­یاب تعیین توالی شد. در مرحله­ی بعد با کاربرد نرم­افزار پاپ ژن، توالی به­دست آمده برای ژن­ استخراج شده و ارقام زود­رس و دیر­رس مورد مقایسه قرار گرفت و اختلافات موجود از نظر حذف تک نقطه­ای و یا قطعه­ای و یا اضافه شدن ارزیابی شد. در این تحقیق اثر اسید آبسیزیک نیز بر شاخص­های پیری مورد بررسی قرار گرفت. 2-1- اهداف 1- تشخیص تفاوت­های توالی ژن­ مذکور (α-Man) بین دو رقم زود­رس و دیررس و تشخیص هرگونه تفاوت در توالی هر تک نوکلئوتید یا موتاسیون تک نقطه­ای و مقایسه­ی این ژن­ها بین ارقام گیلاس زود­رس با انبارداری پایین و دیر­رس با انبارداری بالا 2- مقایسه­ شاخص­های پیری بین این دو رقم گیلاس زود­رس و دیر­رس 3- تعیین تغییرات گلوکز، فروکتوز در زمان رسیدگی و پیری و طیف تغییرات آنها در میوه گیلاس 3-1- فرضیه ها 1- ارقام گیلاسی که دیر­رس و دارای طول عمر انبار­داری زیادتر هستند، دارای تفاوت در توالی ژن­ مربوطه می­باشند که این احتمالا مربوط به منطقه دومین آنزیم می­باشد. 2- کاربرد هورمون اسید آبسیزیک در ارقام دیر­رس باعث بروز پیری با تاخیر بیشتری نسبت به ارقام زود­رس می­گردد.